噬菌體抗體ELISA

噬菌體ELISA快速而便捷，尤其是因?yàn)閜Ⅷ有多拷貝會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的擴(kuò)增。不過，后續(xù)的抗體檢測(cè)總是要以其可溶性形式進(jìn)行。

[器材和試劑]
● 96孔ELISA板，例如Nunc maxisorb442404（可自VWR購(gòu)得）
● 2％MPBS
● PBS/Tween
● 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的小鼠抗噬菌體單克隆抗體（mAb）（Amer Sham BiOSCiences）
● 3，3’，5，5’—四甲基聯(lián)苯胺（TMB）液體底物系統(tǒng)（SigmaT—8665）
● 終止液（1mol/L H2SO4）
● 噬菌體樣品

[方法]
1．按每孔100ul蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug/m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。
2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。
3．加入200wl的2％MPBS封閉板孔，37℃孵育2小時(shí)。
4．用PBS洗滌板孔 3次。
5．每孔加入SOpl的4％MPBS。
6．每孔加入50ul含噬菌體抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時(shí)。
7．棄去溶液，用PBS/Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次。
8．將HRP標(biāo)記的小鼠抗噬菌體單抗用2％MPBS按照1：5000稀釋后，每孔加入100ul；室溫孵育1小時(shí)。
9．棄去二抗，并用PBS/Tween和PBS分別洗滌3次。
10．每孔加入100ul TMB系統(tǒng)溶液，并在暗處室溫孵育10～30分鐘。數(shù)分鐘內(nèi)，應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。
11．每孔加入50～100ul終止液，終止反應(yīng)。
12．在450nm處讀板。

除了用噬菌體（粒）進(jìn)行ELISA外，也可以用可溶性片段。在噬菌粒展示載體上抗體片段的表達(dá)受控于1acZ啟動(dòng)子。在無(wú)葡萄糖的條件下，可以終止1acZ啟動(dòng)子的代謝抑制作用，而它卻可為IPTG所誘導(dǎo)?？贵w片段的表達(dá)是以一種被動(dòng)方式滲漏到上清中（部分原因是其對(duì)大腸桿菌所產(chǎn)生的毒性）的。應(yīng)當(dāng)注意的是，有些抗體片段，例如那些毒性不很大的抗體在外周質(zhì)中滯留的蛋白（甚至過夜培養(yǎng)后）比上清中所存在的要多些。

本處所述方法取決于起始培養(yǎng)基中可代謝的葡萄糖量（0．1％）在誘導(dǎo)劑（1PTG）加入時(shí)要足夠低。這可以避開所有的離心步驟并降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。