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2013ELISA試劑盒的影響因素

2013-10-05 [847]

ELISA試劑盒的影響因素
這是ELISA檢測(cè)中的重要部分,可從以下方面加以說(shuō)明。
        (一)固相載體:可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式,這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體,如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少,操作方便,適合于大規(guī)模應(yīng)用。國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板(上海塑料三廠出品)目前已大量應(yīng)用于ELISA測(cè)定,并且獲得了滿意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明,吸附效果似乎與塑料的類(lèi)型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的很大差異,甚至*喪失吸附能力。因此,對(duì)每批制品在使用前,必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定,鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣,用0.2ug/ml純化的正常人IgG進(jìn)行包被,經(jīng)洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng),再經(jīng)孵育洗滌,加底物顯色終止反應(yīng)后,逐孔在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其消光值、光密度(O.D值)。一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组gO.D值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大,或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大,均不合格。此外,還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格,微量反應(yīng)板或塑料管在使用前并不一定通過(guò)特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。
(二)抗原:在 ELISA試劑盒 中,包被于固相載體表面的抗原或抗體的來(lái)源和制備方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的,而且要求是和穩(wěn)定的制劑,純度和免疫原性要高。如果不純,由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置,降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。經(jīng)試驗(yàn)證明,適用于其他血清學(xué)試驗(yàn)的抗原并非均適合用于ELISA法。因此,對(duì)某一疾病的診斷,必須通過(guò)實(shí)踐,才能選出適用的抗原。對(duì)大多數(shù)傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷中所用的抗原并非要求十分嚴(yán)格,一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的可溶性抗原均可用于ELISA,例如超聲波抗原、凍融抗原、細(xì)菌的外膜抗原、脂多糖(LPS)、細(xì)菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等,在作ELISA時(shí),必須要有1-2種試劑、要求純化,但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑,否則就不易吸附到固相載體上去。此外,對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純,如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等,它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì),必須設(shè)法除去,常用梯度超速離心或親和層析法提純,不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時(shí)也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時(shí)選擇的濃度要適當(dāng)。如濃度太高,則低效價(jià)抗體可能測(cè)不出來(lái),或包被過(guò)量形成多層抗原吸附,故在操作過(guò)程中可能脫落從而降低敏感性和可重復(fù)性。用zui適稀釋度抗原,包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì),而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進(jìn)行包被zui為合適呢?可通過(guò)棋盤(pán)滴定法進(jìn)行測(cè)定,但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便,其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板,再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應(yīng)后分別測(cè)定O.D值,選擇O.D值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)O.D值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外,對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高(如37℃、45℃、或56℃),包被時(shí)間可縮短,溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。
(三)試驗(yàn)樣品:血清、血漿或其他體液,均可作為ELISA的試驗(yàn)樣品(標(biāo)本)。但應(yīng)注意分離血清時(shí),血液要求放置室溫中凝固收縮,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于人血清在保存過(guò)程中抗體的穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作ELISA血清要新鮮,若要貯藏,必須少量分裝保存于低溫冰箱,并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血,而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標(biāo)本,可用含保護(hù)性封阻劑(吐溫-20)或稱(chēng)濕潤(rùn)劑的緩沖液來(lái)稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì),如1%牛血清白蛋白等來(lái)稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測(cè)定,也可用一個(gè)稀釋度測(cè)定。對(duì)于作某一個(gè)傳染病的診斷來(lái)說(shuō),先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測(cè)定,求出對(duì)診斷有意義的一個(gè)稀釋度(即測(cè)定劑量反應(yīng)曲線),然后用一個(gè)稀釋測(cè)定即可。zui適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來(lái),對(duì)一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷,以1:200稀釋度測(cè)定比較適當(dāng),而試驗(yàn)標(biāo)本的(即含抗體)作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現(xiàn)在對(duì)有些標(biāo)本(如流腦抗原)測(cè)定時(shí),僅用37℃ 5分鐘。對(duì)單克隆抗體檢測(cè)也可縮短作用時(shí)間。
(四)結(jié)合物:在 ELISA試劑盒 中,用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱(chēng)為結(jié)合物,此為進(jìn)行ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問(wèn)題是能夠簡(jiǎn)便地制備酶結(jié)合物,而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定,具有很高的酶活性,抗原或抗體的特異性,產(chǎn)量高及成本低。

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